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LightFlash快速内切酶是一系列经过基因工程重组的快速限制性内切酶，适用于质粒DNA、PCR产物或基因组DNA等的快速酶切。所有LightFlash快速内切酶在通用的CutFlash或CutFlash Color Buffer中都具有优良的活性，能够在5～15分钟内完成酶切。此外，百奥莱博的快速碱性磷酸酶、T4 DNA快速连接酶在CutFlash Buffer中均具有100%活性，支持一管化反应，提升“酶切-修饰-连接”的体验。

CutFlash Color Buffer包括红色和黄色示踪染料，可将产物直接用于凝胶电泳。CutFlash Color Buffer的红色染料与2500bp双链DNA片段在1%琼脂糖凝胶中迁移速率接近；黄色染料与10bp双链DNA片段在1%琼脂糖凝胶中迁移速率接近。

• 功能活性检测：37℃下，在20μL通用CutFlash反应体系中，1μL LightFlash AvrII能够在15min内完全消化1μg λDNA (HindIII digest)。
  
• 超长时间温育检测：37℃下，在20μL通用CutFlash反应体系中，将1μL LightFlash AvrII与1μg λDNA (HindIII digest)共同温育3h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解。更长时间酶切可能出现星号活性。
  
• 酶切-连接-再酶切检测：37℃下，使用10倍酶量的LightFlash AvrII消化DNA底物，回收酶切产物，在22℃下使用T4 DNA Ligase (Fast)可以将超过95%的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开95%以上的连接产物。
  
• 非特异性内切酶活性检测：37℃下，在20μL通用CutFlash反应体系中将1μL LightFlash AvrII与1μg超螺旋质粒DNA共同温育4h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于10%的质粒DNA转变成缺刻或线性状态。
  
• 蓝白斑检测：使用1μL LightFlash AvrII消化含有lacZα基因且仅在该基因上具有1个酶切位点的特定载体。将酶切产物重新连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂布在含有X-gal、IPTG和相应抗生素的LB平板培养基上生长。成功连接的β-半乳糖苷酶基因可以正确表达，并生长出蓝色菌落；而因酶切末端降解等原因未能重新连接的产物将得到白色菌落。对于LightFlash系列限制酶而言，白色菌落的比例应当小于1%。

• 不同DNA中的酶切位点数量
  

  λDNA	ΦX174	pBR322	pUC57	pUC18/19	SV40	M13mp18/19	Adeno2
  2	0	0	0	0	2	0	2

• 甲基化修饰影响
  

  Dam	Dcm	CpG	EcoKI	EcoBI
  无影响	无影响	无影响	无影响	无影响

• 在不同反应缓冲液中的活性
  

  CutFlash Buffer	FastDigest Buffer	CutSmart Buffer	QuickCut Buffer
  100%	100%	100%	100%

  注：活性数据来自百奥莱博限制酶标准反应体系下的检测。

• DNA快速酶切流程
  
  • 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：
    

    成分	质粒DNA	PCR产物	基因组DNA
    ddH2O	15μL	16μL	30μL
    10×CutFlash Buffer	2μL	3μL*	5μL
    底物DNA	2μL (up to 1μg)	10μL (~0.2μg)	10μL (5μg)
    LightFlash AvrII	1μL	1μL	5μL
    Total	20μL	30μL	50μL

    注^*：本体系适用于经过纯化的PCR产物酶切。未纯化的PCR产物具备一定的离子强度，10×CutFlash Buffer加入量可适当减少至2μL。但由于DNA聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对PCR产物进行纯化。
    
  • 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；
    
  • 37℃温育15min（质粒），或15～30min（PCR产物），或30～60min（基因组DNA）；
    
  • 酚氯仿抽提或柱纯化（可选）；
    
  • 如果使用CutFlash Color Buffer进行酶切反应，得到的产物可以直接进行上样电泳。
• 双酶切或多酶切
  
  • 每种快速内切酶的用量为1μL，并根据需要适当扩大反应体系；
    
  • 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的1/10；
    
  • 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切
    反应。
• 适用于质粒的扩大反应体系
  

  DNA(μg)	1	2	3	4	5
  LightFlash AvrII(μL)	1	2	3	4	5
  10×CutFlash (μL)	2	2	3	4	5
  总体积(μL)	20	20	30	40	50

  注：如果总反应体系大于20μL，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。